Nach seinen letzten Heldentaten kann Peter Parker (Tobey Maguire) seine Berühmtheit als Spider-Man genießen: Die Stadt liegt ihm zu Füßen und feiert ihn überschwänglich. Und auch privat scheint alles bestens zu laufen: Peter plant, seiner geliebten Mary Jane (Kirsten Dunst) baldmöglichst einen Heiratsantrag zu machen. Zuvor bespricht er sich aber noch mit seiner Tante May (Rosemary Harris), die ihm, überglücklich über diese Nachricht, den Ring schenkt, den sie einst von … mehrihrem Ehemann Ben (Cliff Robertson) bekam, der vor einiger Zeit ermordet wurde. Bens mutmaßlichem Mörder, Flint Marko (James Haden Church), gelingt die Flucht aus dem Gefängnis. Gehetzt von der Polizei gelingt es ihm dennoch, sich Zutritt zur Wohnung seiner Frau Emma (Theresa Russell) und zum Zimmer seines todkranken Kindes zu verschaffen. Als Emma ihn erwischt, kommt es zu einer dramatischen Aussprache, in der klar wird, das Marko seine Raubzüge allein deswegen unternimmt, um seiner Tochter eine lebensrettende Operation zu ermöglichen. Nur kurz kann er mit ihr sprechen, dann schickt ihn Emma hinaus in die Nacht, wo seine Verfolger die Spur wieder aufnehmen. Bei der Verfolgungsjagd stürzt Marko aus Versehen in den Partikelbeschleuniger eines Forschungsinstituts, was fatale Folgen hat. Der Apparat mixt seine Gene mit Sand, so dass er nach einer kurzen Regenerationsphase über ganz erstaunliche Kräfte verfügt, die er bei seinen Überfällen bestens zur Geltung bringen kann. Spider-Man hat große Mühe, den zum Sandmann mutierten Marko in seine Schranken zu weisen. In der ersten Reihe eines Broadway-Theaters sitzt Peter, der sich auf die Premiere des Musicals freut, in dem Mary Jane eine Rolle ergattert hat. Voller Stolz lauscht er einem Solo-Auftritt von ihr, ohne zu ahnen, dass auf dem Zuschauer-Balkon jemand sitzt, der ihn nicht aus den Augen lässt: Sein ehemaliger Freund Harry Osborn (James Franco), der Peter für den gewaltsamen Tod seines Vaters Norman (Willem Dafoe) verantwortlich macht. Nach der Vorstellung besucht Peter Mary Jane in ihrer Garderobe und bemerkt dort den riesigen Blumenstrauß, viel größer als der, den er ihr hat schicken lassen. Der stammt natürlich von Harry, der die nächste sich bietende Gelegenheit nutzt, sich mittels modernster Technik in den "New Goblin", den neuen Kobold, verwandeln zu lassen und gegen Spider-Man anzutreten. In den finsteren Häuserschluchten New Yorks tobt zwischen den beiden ein wilder, atemberaubender, aber auch gefährlicher Kampf, den Harry schließlich schwerverletzt überlebt - allerdings mit erheblichen Gedächtnislücken, die seine alte Freundschaft mit Peter wieder aufleben lassen. Ohne dass sie es bemerken, geht unweit der Stelle, an der sich Mary Jane und Peter zu einem romantischen, nächtlichen Rendezvous einfinden, ein Meteorit in Manhattan nieder. Aus seinem Kern bahnt sich eine schleimig-schwarze, amorphe Masse ihren Weg, der sehr bald in Peters Wohnung endet. Es handelt sich um einen Symbionten, also eine unbekannte Lebensform, die einen Wirt, ein Opfer braucht, von dem sie Besitz ergreift. Als sich nachts die Masse über den schlafenden Peter stülpt, erwacht der aus einem Alptraum und findet sich schon im nächsten wieder: Sein Spider-Man-Outfit schillert plötzlich schwarz statt rot, seine ohnehin schon unglaublichen Fähigkeiten bekommen einen zusätzlichen Schub. Und genau die wird er nun gegen den Sandmann einsetzen. In den New Yorker U-Bahnschächten und dem benachbarten Untergrund kommt es zum scheinbar finalen Duell, bei dem schließlich Spider-Mans Widersacher von Wasser aufgelöst in die Kanalisation gespült wird. Peter brennt darauf, seiner Tante May zu erzählen, dass Spider-Man den Mörder ihres Mannes zur Strecke gebracht hat. Die ist freilich entsetzt, kann es kaum glauben, denn erstens hätte Ben niemals Rache befürwortet, und zweitens, so ist sie überzeugt, würde Spider-Man niemals töten. Noch in derselben Nacht legt Peter das gefährliche schwarze Spider-Man-Kostüm ab und verstaut es in einer Truhe. Aber schon droht noch mehr Unheil: Peter bekommt in seinem Nebenjob als Pressefotograf Konkurrenz. Der smarte Eddie Brock (Topher Grace) versucht Peter beim "Daily Bugle" auszustechen. Und der skrupellose Verleger J. Jonah Jameson (J.K. Simmons) scheint nicht abgeneigt, dem cleveren Newcomer eine Chance zu geben. Doch Eddies Fotos von Spider-Man gefallen ihm nicht. Er will die dunkle Seite Spider-Mans auf der Titelseite haben und schickt Eddie wie Peter los, diese aufzuspüren und im Bild festzuhalten. Dem Gewinner dieses dubiosen Wettbewerbs winkt eine Festanstellung bei der Zeitung. Peter kann einfach nicht widerstehen, die dunkle Macht hat bereits zu sehr von ihm Besitz ergriffen und sein Wesen zeigt sich immer unangenehmer, gewalttätiger und bösartiger. Aber auch Harry lässt den Abgründen in seiner Seele freien Lauf, nachdem er sein Gedächtnis wiedererlangt hat. Er behauptet Peter gegenüber, eine heiße Nacht mit Mary Jane verbracht zu haben und bringt sie sogar dazu, sich von ihm zu trennen. Es kommt erneut zu einem Zweikampf zwischen Peter und Harry, der diesmal an Brutalität kaum zu überbieten ist. In der finalen Phase wirft Peter eine Granate auf den schon am Boden liegenden Harry, was dessen Gesichtshälfte entstellt. Der "böse" Spider-Man kennt keine Gnade. Auch nicht, als es darum geht, Eddie Brock auszuschalten. Der hat sich mit einer Fotomontage, die Spider-Man kompromittiert, in den festen Job beim "Daily Bugle" katapultiert und ist den Job genauso schnell wieder los wie er ihn bekommen hat, nachdem Peter den Betrug aufdeckt. Auch Peters Verhältnis zu Mary Jane wird durch seine eklatante Wesensveränderung mehr und mehr getrübt: Der Abend, an dem er ihr in einem teuren Restaurant den Antrag machen will, endet schon mal mit einem Reinfall. Und Mary, die auf Grund schlechter Kritiken vom Theater gefeuert wurde und jetzt in einer Jazzkneipe als singende Kellnerin jobbt, ärgert sich sehr über einen Kuss, den Spider-Man bei der Verleihung der Ehrenbürgerschaft der Tochter des Polizeichefs, Gwen (Bryce Dallas Howard), in seinem egomanischen Überschwang gegeben hat. Als es bei Peters Besuch des Jazzlokals zu einem Handgemenge kommt und er aus Versehen Mary Jane zu Boden schlägt, weiß er mit einem Mal, dass er sich auf der Stelle von dem Symbionten und seiner Macht trennen muss. Dies gelingt ihm zwar auf schmerzvolle Weise, doch ein neuer Wirt ist schnell gefunden: Der von Rachegelüsten zerfressene Eddie Brock mutiert mit dessen Hilfe zum Monster Venom und der verbündet sich mit dem Sandmann, der keineswegs besiegt oder gar getötet wurde. Diese Allianz der Bösen greift zum hinterhältigsten Mittel: Sie entführen Mary Jane und erklären Spider-Man den Krieg. Den aber kann Spider-Man nur gewinnen, wenn er nicht alleine kämpft ... weniger